1.1.2 要試劑和儀器 RIZOL(LifeTechnology公司,美國)、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(LifeTechnology公司,美國),PCR試劑(TaKaRa公司,日本),SYBRGREENI染料(MolecularProbes公司,美國),RotorGene3000熒光定量PCR儀(CorbettResearch公司,澳大利亞)。

1.2 方法

1.2.1RNA提取和cDNA合成 將正常組和水楊酸鈉作用組的大鼠，分別剝離耳蝸，再在顯微鏡下去掉骨質(zhì)外殼，將其內(nèi)容物勻漿，然后用TRIzol法(LifeTechnologies公司)抽提總RNA。取1μg的總RNA,用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶,按照其說明書進(jìn)行cDNA的合成,-20℃保存。

1.2.2 引物大鼠基因 HSP27引物，上游引物:5′CAAGGAAGGCGTGGTGGAGA3′;下游引物:5′TGGTGACGGCTACTGGGGAT3′，產(chǎn)物長度311bp。大鼠βactin引物，上游引物:5′TTGTAACCAACTGGGACGA;ATGG3′;下游引物:5′GATCTTGATCTTCATGGTGCT;AGG3′產(chǎn)物長度:764bp。

1.2.3 實(shí)時定量PCRSYBRGREENI(MolecularProbes)原液存儲 在二甲基硫氧化物中,初始濃度為10000倍,將其稀釋為50倍作為工作液,分裝后,-20℃避光保存。

1.2.3.1 大鼠βactin的PCR反應(yīng) 引物0.5μmol•L-1,dNTP0.2mmol•L-1,MgCl23mmol•L-1,Taq酶1U,SYBRGREENI0.5倍，1×PCRbuffer,總體積為25μL，循環(huán)：94℃變性3min,開始循環(huán)：94℃30s,56℃30s,72℃50s,72℃5s檢測熒光，共40個循環(huán)。

1.2.3.2 大鼠HSP27的PCR反應(yīng) 引物0.5μmol•L-1,dNTP0.2mmol•L-1,MgCl23mmol•L-1,Taq酶1U,SYBRGREENI0.5倍，1×PCRbuffer,總體積為25μL，循環(huán)：94℃變性3min,開始循環(huán)：94℃30s,55℃30s,72℃40s,72℃5s檢測熒光，共40個循環(huán)。

1.2.4 基因表達(dá)的定量分析 采用Livak等設(shè)計(jì)的比較閾值法來測定目的基因的相對表達(dá)，目的基因的量=2^^Ct，在該公式中Ct是熱循環(huán)儀檢測到反應(yīng)體系中熒光信號的強(qiáng)度值，ΔΔCt=(Ct,目的基因Ct,管家基因)實(shí)驗(yàn)組(Ct,目的基因Ct,管家基因)對照，所以，2^^Ct表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù)，使用這一方法可以直接得到的目的基因相對于管家基因的定量。

1.3 數(shù)據(jù)收集及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)收集主要由RotorGene3000自帶軟件完成。通過軟件計(jì)算出所有樣本，包括目的基因和管家基因的起始循環(huán)數(shù)(Ct),用公式法計(jì)算目的基因的量。采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2、結(jié)果

大鼠耳蝸目的基因HSP27和內(nèi)參基因βactin擴(kuò)增完成后，以1.5%瓊酯糖凝膠電泳進(jìn)行產(chǎn)物鑒定(圖1、2);水楊酸鈉作用組和正常對照組的HSP27基因和βactin在各自的反應(yīng)條件下進(jìn)行熒光定量PCR測定，反應(yīng)結(jié)束后,通過電腦分析,直接得出定量結(jié)果;慢性水楊酸鈉作用組內(nèi)參基因βactin和目的基因HSP27的起始循環(huán)數(shù)(圖3、4);實(shí)驗(yàn)組和對照組中目的基因和管家基因的起始循環(huán)數(shù)及其計(jì)算結(jié)果，并經(jīng)t檢驗(yàn)，P<0.01，兩組對照其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由表1可知慢性水楊酸鈉注射后(實(shí)驗(yàn)組)大鼠耳蝸中HSP27的基因表達(dá)增強(qiáng),是對照組的3.16倍。

3、討論

HSP27是HSP家族中小分子量熱休克蛋白(sHSP)亞家族中的一員,分子量為27KD[2]，分為構(gòu)成型和誘導(dǎo)型。以往的研究已經(jīng)表明，HSP27家族除了參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化及作為分子伴侶保護(hù)細(xì)胞功能之外，還參與微絲的穩(wěn)定與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，防止應(yīng)激后肌動蛋白(actin)微絲碎裂,調(diào)節(jié)Factin多聚化,影響細(xì)胞骨架及細(xì)胞遷移等。

Leonova等[4]報告，HSP27在正常大鼠耳蝸內(nèi)主要存在于外毛細(xì)胞的側(cè)壁、頂部、Reissner′s細(xì)胞膜等，在我們前期的研究中也得出了相同的結(jié)果[5]。外毛細(xì)胞是聽覺過程中機(jī)械-電能轉(zhuǎn)換的部位，其外側(cè)壁由三部分組成，最外層為細(xì)胞質(zhì)膜層(protoplasmicmembrane，PM)，中間為富含肌動蛋白的細(xì)胞骨架網(wǎng)(cytoskeleton，CL)，最內(nèi)層為細(xì)胞表面下池(subsurfacecisternae，SSC)。正常耳蝸功能的維持與外毛細(xì)胞尤其是外側(cè)壁結(jié)構(gòu)的完整性密切相關(guān)，因此，Leonova等推測HSP27在正常大鼠耳蝸中持續(xù)表達(dá)，其作用可能是維持和穩(wěn)定外毛細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架，從而對抗外毛細(xì)胞在正常聽覺過程中所受到的機(jī)械應(yīng)力。

HSP27基因在啟動子區(qū)有熱休克調(diào)節(jié)元件(HeatShockRegulatoryElement,HSE)及應(yīng)激相關(guān)調(diào)節(jié)元件(StressrelatedRegulatoryElement,STRE)，其表達(dá)受熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(HeatShockTranscriptionFact1,HSF1)的調(diào)控。HSF1在大鼠耳蝸內(nèi)的分布與HSP27的表達(dá)部位一致，但位于細(xì)胞核內(nèi)。在非應(yīng)激狀態(tài)細(xì)胞內(nèi)HSF1以非活性的單體形式存在，非活性HSF1經(jīng)三聚化和絲氨酸磷酸化在應(yīng)激條件下(如耳毒性藥物，噪聲損傷等)激活，活化的HSF1與HSP27基因中應(yīng)激相關(guān)調(diào)節(jié)元件結(jié)合，從而激活HSP27基因,使其增加。Kazuma等[6]研究發(fā)現(xiàn)，HSF1基因敲除鼠雖然聽力正常，但在應(yīng)激條件下熱休克蛋白的表達(dá)不再增加。

關(guān)于水楊酸鈉耳毒性作用，Cazals等[7]通過對聽覺電生理的研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸鈉能引起可逆性的耳蝸復(fù)合動作電位閾值升高及耳聲發(fā)射幅值下降或升高，提示水楊酸鹽耳毒性的主要作用部位在耳蝸、特別是外毛細(xì);形態(tài)學(xué)方面，羅燕云等[8]指出，慢性水楊酸鈉注射2周豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞出現(xiàn)了SSC擴(kuò)張性空泡形成，同時外毛細(xì)胞靜纖毛柔軟、彎曲，表皮板局部溶解。Allen等[9]報告，離體外毛細(xì)胞在不同濃度的水楊酸鈉溶液中其外側(cè)壁的硬度顯著降低，認(rèn)為這與水楊酸鈉對外側(cè)壁質(zhì)膜層和細(xì)胞表面下池的直接損傷相關(guān)。外毛細(xì)胞及靜纖毛順應(yīng)性的改變導(dǎo)致靜纖毛與蓋膜失耦合，引起膜離子通道異常開放，一方面可能導(dǎo)致靜纖毛異常擺動的機(jī)械能轉(zhuǎn)換成電能而傳入，另一方面可能通過蓋膜與內(nèi)毛細(xì)胞較長靜纖毛的緊密接觸而影響到內(nèi)毛細(xì)胞，使內(nèi)毛細(xì)胞興奮性增強(qiáng)，異常電信號傳入。在缺乏外界聲刺激時，異常電信號傳入引起聽覺通路上自發(fā)活動增強(qiáng)[11]，引起耳鳴。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們比較了慢性水楊酸鈉作用后與正常對照組之間耳蝸組織中HSP27基因表達(dá)變化，結(jié)果表明，長期大劑量水楊酸鈉注射后大鼠耳蝸中HSP27基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，達(dá)到3.16倍。我們前期的研究表明[5]，慢性水楊酸鈉作用后HSP27表達(dá)增強(qiáng)的主要部位為外毛細(xì)胞。HSP27表達(dá)增強(qiáng)可能是對外毛細(xì)胞進(jìn)一步損傷的保護(hù)，防止應(yīng)激后肌動蛋白微絲碎裂，穩(wěn)定外毛細(xì)胞的細(xì)胞骨架[12]。水楊酸鈉是直接激活HSF1而啟動HSP27基因表達(dá)，還是在損傷過程激活HSF1其機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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