非綜合征性唇腭裂患者血漿代謝組學(xué)的初步研究
【摘要】目的:初步研究非綜合征性唇腭裂患者可能存在的代謝機制,同時探討基于核磁共振(NMR)的代謝組學(xué)技術(shù)在臨床應(yīng)用中的可行性。方法:分別收集10例非綜合征性唇腭裂患者和10例正常人的血漿,在核磁共振儀上對血漿樣本進(jìn)行采樣,獲得一系列原始的一維NMR譜圖,然后使用MESTRE-v4.7軟件對NMR譜圖進(jìn)行積分簡化數(shù)據(jù),將譜圖分解成212個區(qū)域進(jìn)行積分,得到積分強度,利用SIMCA-P11.0軟件對積分強度進(jìn)行主成分分析。結(jié)果:非綜合征性唇腭裂患者和正常人的血漿代謝存在差異,至少存在3種不同的代謝產(chǎn)物,分別為三羥丁酸γ甲基類物質(zhì)、精氨酸和纈氨酸。非綜合征性唇腭裂患者血漿代謝產(chǎn)物以纈氨酸和三羥丁酸γ甲基類物質(zhì)為主,而正常人血漿代謝產(chǎn)物則以精氨酸為主。結(jié)論:通過代謝組學(xué)技術(shù),可以初步探討非綜合征性唇腭裂患者的代謝機制,同時該技術(shù)有望應(yīng)用于臨床。
【關(guān)鍵詞】代謝組學(xué);非綜合征性唇腭裂;主成分分析
非綜合征性唇腭裂是口腔頜面部最常見的先天性發(fā)育畸形,占整個頜面部面裂畸形的70%以上。該病發(fā)病因素復(fù)雜,對其病因?qū)W的研究意義重大。若能明確其發(fā)病原因,并采取有效的干預(yù)措施,有望從根本上預(yù)防該疾病的發(fā)生。目前,對唇腭裂的病因?qū)W研究取得了一定的進(jìn)展,如發(fā)現(xiàn)唇腭裂是多因素遺傳疾病,與孕期吸煙、用藥等因素有關(guān)等①③,但其確切的代謝機制和發(fā)病原因尚不清楚。本文通過研究非綜合征性唇腭裂患者血漿的代謝機制,推斷其潛在的發(fā)病原因,同時探討基于核磁共振(nu-clearmagneticresonance,NMR)的代謝組學(xué)在臨床應(yīng)用中的可行性。
1、材料和方法
1.1 試驗儀器
本試驗使用的主要儀器有:BrukerAvanceDRX600核磁共振儀(Bruker公司,德國);XYJ80-2低速離心機(江蘇金壇實驗儀器有限公司);MR1812高速離心機(Jouan公司,法國);4mL肝素鈉抗凝管(BectonDickinson公司,美國);FD-1冷凍干燥機(北京博康實驗儀器有限公司)。
1.2 研究對象的選擇
隨機選擇2004—2005年在四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院唇腭裂外科行手術(shù)治療的非綜合征性唇腭裂患者10例作為病例組,其中單純性腭裂患者6例,唇裂并發(fā)腭裂患者4例;女性8例,男性2例;年齡6~19歲,平均年齡(12.6±6.5)歲。同時隨機選擇2004—2005年在四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心婦幼保健院查體的健康人10例作為對照組,女性8例,男性2例;年齡7~20歲,平均年齡(13.0±5.1)歲。病例組納入標(biāo)準(zhǔn):診斷為非綜合征性唇腭裂的患者,無其他系統(tǒng)性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn):1)患有綜合征性唇腭裂如Shprintzen綜合征或Robbin綜合征者;2)患有先天性代謝缺陷
如楓糖尿癥患者;3)臨床生化結(jié)果異常者,或者患有血液系統(tǒng)疾病者;4)傳染病患者如獲得性免疫缺陷綜合征、B或C型肝炎等④⑤。
1.3 研究方法
1.3.1 樣本采集及處理 樣本采集前,2組研究對象要求空腹6h。樣本采集于上午9時左右在室溫下進(jìn)行。抽取研究對象靜脈血液4mL,緩慢注入4mL肝素鈉抗凝管中,室溫下1500r/min低速離心10min,以去除全血中血細(xì)胞等大分子物質(zhì)。離心后用移液槍吸取上清液(即血漿)2mL放入EP管內(nèi),進(jìn)行二次離心(4℃下20000r/min離心10min),以去除血漿中的雜質(zhì),保留血漿中的小分子代謝物質(zhì)。離心后吸取上清液1.8mL放入干凈的EP管內(nèi),將樣本進(jìn)行凍干處理,然后保存在-20℃低溫冰箱中備用。
1.3.2 NMR數(shù)據(jù)的采集 將凍干處理過的血漿樣本在室溫下解凍,將450μL解凍樣本移入干凈的核磁管內(nèi),以體積比1∶10的比例緩慢加入重水至500μL,混勻,靜置5min。每個樣本制備完成后直接在核磁共振儀上進(jìn)行光譜采集,獲得原始的一維氫譜。光譜采集在室溫下進(jìn)行,采樣點數(shù)是32k,累加次數(shù)128次,核磁共振儀實際工作頻率為600.13MHz。掃描對水峰進(jìn)行抑制的原始一維氫譜,可以獲得
131072個數(shù)據(jù)點,其峰寬度為7788.16Hz,最小頻率為-1073.15Hz。掃描未進(jìn)行水峰抑制的氫譜同樣可獲得131072個數(shù)據(jù)點,其峰寬度為7183.91Hz,最小頻率為-651.29Hz。
1.3.3 NMR數(shù)據(jù)后加工過程和化學(xué)計量分析方法 所有樣本的自由感應(yīng)衰減(freeinductiondecay,F(xiàn)ID)信號導(dǎo)入MESTRE-v4.7軟件進(jìn)行傅里葉轉(zhuǎn)換(Fouriertransform,F(xiàn)T),獲得一維NMR譜圖,將所獲得的譜圖進(jìn)行基線調(diào)整。由于δ4.52~6.00含有水峰⑥⑦,該區(qū)域的化學(xué)位移被排除在外。將各個樣本的氫譜δ0~4.52及δ6~10按bin0.04為單位進(jìn)行分割,得到212個化學(xué)位移值段,進(jìn)一步按各化學(xué)位移值段分別積分,即得到與各個化學(xué)位移值段相對應(yīng)的積分值,這樣就簡化了原始數(shù)據(jù)(圖1)。對每個樣本進(jìn)行光譜采集,可獲得20組數(shù)據(jù),構(gòu)成1個n×d二維矩陣(其中n為樣本組數(shù),d為積分區(qū)間數(shù)),這樣更具有統(tǒng)計學(xué)意義。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel文件中備用。使用SIMCA-P11.0軟件對該二維矩陣進(jìn)行化學(xué)計量處理,主要進(jìn)行主成分分析(principalcompo-nentanalysis,PCA)。
2、結(jié)果
本研究中所建立的新變量模型含有9個主成分(principalcomponent,PC),前2個主成分(PC1和PC2)的累積貢獻(xiàn)率為93.5%,說明所建立的變量具有很好的預(yù)測性。前2個主成分的PC圖見圖2。由圖2可以看出,對照組樣本間變異較大,病例組樣本間則具有高度相似性,但這2個主成分不能完全區(qū)分2組的樣本。第2和第3個主成分(PC2和PC3)的PC圖見圖3,這2個主成分可以區(qū)分病例組和對照組,因此筆者選用PC2和PC3作為研究對象。圖4為PC2和PC3的因子負(fù)荷圖,可見圖中大多數(shù)點集中于原點,表現(xiàn)為重疊點,即具有相同的代謝產(chǎn)物,也就是說病例組和對照組具有相同的代謝產(chǎn)物;但是有少數(shù)的點遠(yuǎn)離原點,這些點所代表的化合物造成了某些樣本間血漿代謝物的差異,主要表現(xiàn)為氨基酸及脂類物質(zhì)的異常代謝。對這些異常代謝物作進(jìn)一步分析,引起這種差異的代謝物的NMR峰主要集中在δ1.20、δ1.80、δ3.60(圖4)。對發(fā)生變化的NMR譜峰進(jìn)行分析,這些化學(xué)位移值分別代表一些氨基酸及脂類物質(zhì),如精氨酸、纈氨酸和三羥丁酸γ甲基類物質(zhì)等⑥⑧。對照組血漿代謝產(chǎn)物中以精氨酸為主,而病例組血漿代謝產(chǎn)物則含有三羥丁酸γ甲基類物質(zhì)和纈氨酸。
3、討論
先天性唇腭裂危害著口腔頜面器官的形態(tài)及功能,嚴(yán)重影響了出生人口素質(zhì)及母嬰身心健康。從遺傳學(xué)上,該疾病可分為綜合征性唇腭裂與非綜合征性唇腭裂,其中非綜合征性唇腭裂最為多見。非綜合征性唇腭裂是一個復(fù)雜的、由遺傳和環(huán)境因素相互作用所致的疾病,其代謝產(chǎn)物可能會出現(xiàn)異常表達(dá)。本研究運用代謝組學(xué)對10例非綜合征性唇腭裂患者和10例正常人進(jìn)行分析,初步了解非綜合征性唇腭裂患者的代謝機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),非綜合征性唇腭裂患者和正常人在血漿代謝產(chǎn)物上存在差異,其差異主要表現(xiàn)在某些氨基酸的異常代謝上,如精氨酸和纈氨酸。正常人血漿代謝產(chǎn)物中以精氨酸為主,而非綜合征性唇腭裂患者血漿代謝產(chǎn)物則含有三羥丁酸γ甲基類物質(zhì)和纈氨酸。精氨酸是鳥氨酸循環(huán)中的重要組成成分,具有極其重要的生理功能,在嬰幼兒發(fā)育中起著重要的作用,若缺乏則不能維持嬰幼兒正常的生長與發(fā)育。纈氨酸為必需氨基酸,作用于黃體、乳腺及卵巢,其功能主要是維持神經(jīng)系統(tǒng)功能正常。三羥丁酸γ甲基類物質(zhì)在血漿中表現(xiàn)為低密度脂蛋白,在某些腫瘤患者血漿中表現(xiàn)為高表達(dá)的巖藻糖甲基脂蛋白。
本研究結(jié)果提示,運用代謝組學(xué)技術(shù)可以早期篩查某種疾病并探討其代謝機制,也說明在此基礎(chǔ)上推斷其潛在的發(fā)病原因是可行的。但本研究僅僅在技術(shù)方法上進(jìn)行了一些探索,得出了部分有意義的結(jié)果,在下一步工作中,筆者擬從兩方面進(jìn)行深入的研究:一方面嚴(yán)格控制受試者的飲食,主要是禁止食用含有魚肉和櫻桃等食品,因為代謝組學(xué)容易受到飲食習(xí)慣、生活方式和文化差異等因素的影響;另一方面應(yīng)擴大樣本含量,使其更具有統(tǒng)計學(xué)意義。研究生物體液最有效和全面的方法是對其基因、蛋白質(zhì)表達(dá)水平和代謝濃度同時進(jìn)行監(jiān)測。如何把代謝組學(xué)數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、遺傳學(xué)、酶學(xué)、代謝途徑和表現(xiàn)型分析的數(shù)據(jù)整合在一起,并給出生物學(xué)功能的解釋是很艱巨的任務(wù)。它們的整合除了需要適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)庫外,還需要多種先進(jìn)的數(shù)學(xué)分析方法。隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)認(rèn)識的不斷深入和研究工作的不斷積累,這些技術(shù)必將會越來越廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究之中。
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