中藥單體欖香烯體外對人晶狀體上皮細胞內(nèi)膠原蛋白合成的影響
【摘要】目的:探討中藥單體欖香烯(effectsofe lemene,Ele)對人晶狀體上皮細胞系(humanlen sepithelialcellsB3,HLE B3)內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白合成的影響。方法:利用10μg/L堿性成纖維細胞生長因子(recombinanthuman basicfibro blastgrowth factor,rhbFGF)誘導(dǎo)HLE B3增殖,將80mg/L的Ele作用在處于增殖狀態(tài)下的HLE B3,24h后采用雙抗體夾心ABC 酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linkedimmuno sorbentassay,ELISA)檢測Ele作用后HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白表達。結(jié)果:rhbFGF作用后HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白濃度為53.5±5.4μg/L,較正常組(38.5±2.3μg/L)明顯升高,Ele作用后HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白的濃度為29.5±2.9μg/L,較rhbFGF組明顯下降(P<0.01)。rhbFGF作用后HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白濃度為1.27±0.29μg/L,較正常組(0.83±0.12μg/L)明顯升高,Ele作用后HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白的濃度為0.69±0.11μg/L,較rhbFGF組明顯下降(P<0.01)。結(jié)論:Ele抑制rhbFGF誘導(dǎo)的HLE B3增殖的同時也能抑制HLE B3內(nèi)Ⅰ,Ⅲ型膠原蛋白合成,干擾HLE B3纖維化,可望成為防治后囊膜混濁的理想藥物。
【關(guān)鍵詞】欖香烯晶狀體;上皮細胞后囊膜混濁;Ⅰ型膠原蛋白;Ⅲ型膠原蛋白
引言
膠原蛋白(collagen)或稱膠原,是動物細胞合成的一種生物性高分子,是一類最主要的細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)。目前的研究表明,ECM與后囊膜混濁的關(guān)系密切:ECM是構(gòu)成纖維化性混濁的重要成分。免疫電鏡檢查顯示混濁的晶狀體后囊膜的纖維有Ⅰ,Ⅲ和IV型膠原;此外ECM還可調(diào)節(jié)細胞生長分化及細胞運動。欖香烯(elemene,Ele)是天然藥物莪術(shù)的主要成分,具有抗血栓形成、抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡①②,我們的研究發(fā)現(xiàn)Ele能抑制由重組人堿性成纖維細胞生長因子(recombinant human basicfibro blastgrowth factor,rhbFGF)誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細胞系(humanlensepithelialcellsB3,HLE B3)增殖(另文報道),我們進一步采用雙抗體夾心ABC酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linke dimmunosorbentassay,ELISA)檢測Ele作用后HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白(collagenI)和Ⅲ型膠原蛋白(collagenIII)表達,探討Ele是否在抑制HLE B3增殖的同時還能抑制HLE B3內(nèi)Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的合成,從而對阻止晶狀體上皮細胞纖維化起重要的作用。
1、材料和方法
1.1 材料
人晶狀體上皮細胞系HLE B3由廣州中山大學(xué)眼科研究中心提供;Ele乳液,純度99.0%,大連金港制藥有限公司;rhbFGF為英國PeproTech公司;DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和EDTA分別是美國Gibco公司、美國Amresco公司和美國Augus公司;Ⅰ型膠原蛋白(collagenI)和Ⅲ型膠原蛋白(collagenIII)的ELISA試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供。自動酶標讀數(shù)儀:美國BioTekELX808;倒置研究顯微鏡:日本IMT 413;二氧化碳培養(yǎng)箱:美國FORMA2111。取出保存凍存細胞的凍存管立即放入37℃水中,將溶解的細胞懸液用10倍體積以上的培養(yǎng)液進行稀釋,離心,除上清,反復(fù)洗滌3次。以5×108個/L接種于培養(yǎng)瓶中,37℃,50mL/LCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞生長融合后進行傳代培養(yǎng)。
1.2 方法
80mg/LEle作用24h后收集細胞上清液;取出已經(jīng)包被了抗人Ⅰ,Ⅲ型膠原蛋白單克隆抗體的96微孔板。設(shè)標準孔8孔,每孔各加入標準稀釋液100mL,第1孔加標準品100μL,均勻后用加樣器吸出100μL,移至第2孔。如此反復(fù)作對倍稀釋至第7孔,最后從第7孔中吸出100μL棄去,使之體積均為100μL,第8孔為空白組。待測品孔每孔各加入細胞上清液100μL,每組6個孔;將反應(yīng)板充分混勻后置37℃,120min;用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌5次,在濾紙上印干;每孔加第一抗體工作液50μL,置37℃,60min;同前洗板后每孔加酶標抗體工作液100μL,置37℃,60min;同前洗板后每孔加底物工作液100μL,置37℃暗處反應(yīng)10min;每孔加50μL終止液混勻。在492nm處測吸光度值;根據(jù)標準品A值畫出標準曲線,根據(jù)樣品A值在該曲線圖上查出相應(yīng)的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量。
統(tǒng)計學(xué)分析:數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。
2、結(jié)果
rhbFGF組HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白含量較空白組明顯增加,與空白組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01;Ele組HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白含量較rhbFGF組明顯下降,與rhbFGF組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。說明Ele能降低HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白含量。rhbFGF組HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白含量較空白組明顯增加,與空白組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);Ele組HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白含量分別較rhbFGF組明顯下降,與rhbFGF組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。說明Ele能降低HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白含量。Ele對HLE B3內(nèi)Ⅰ,Ⅲ型膠原蛋白含量的影響
3、討論
膠原蛋白或稱膠原,是動物細胞合成的一種生物性高分子,是ECM中最主要的一類物質(zhì)。經(jīng)過數(shù)十年來的研究和發(fā)展,業(yè)已發(fā)現(xiàn)并確認了膠原蛋白有25種類型,其中Ⅰ,Ⅲ型膠原蛋白約占膠原蛋白總量的80%~90%。膠原蛋白纖維化是許多疾病的病理表現(xiàn)之一,膠原蛋白分子的異常合成和沉積是纖維化反應(yīng)的基礎(chǔ)。如彌漫性肺纖維化早期表現(xiàn)為肺泡炎,后期為彌漫性肺間質(zhì)纖維化,主要是肺間質(zhì)中成纖維細胞數(shù)及其產(chǎn)生的膠原蛋白和其他結(jié)締組織成分增多,肺泡壁遭破壞,特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化時,肺組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原增高,肺臟變硬,順應(yīng)性減退③。有研究表明,高血壓左心室肥厚時不僅存在心肌肥大的變化,心肌間質(zhì)纖維化亦是重要的病理改變,Ⅰ,Ⅲ型膠原蛋白的表達增強,促進了間質(zhì)的纖維化④。ECM是構(gòu)成纖維化性混濁的重要成分。免疫電鏡檢查顯示混濁的晶狀體后囊膜的纖維有Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型膠原,ECM可調(diào)節(jié)細胞生長分化及細胞運動。纖維粘連蛋白等ECM可促進某些黏附分子磷酸化,從而促進細胞移行。白內(nèi)障摘除術(shù)后,殘留的晶狀體上皮細胞通過細胞膜上的黏附分子與細胞外基質(zhì)及細胞內(nèi)骨架蛋白相連,促使細胞移行并發(fā)生晶狀體后囊膜皺縮。Ishida等⑤研究發(fā)現(xiàn):米諾地爾能抑制體外培養(yǎng)的晶狀體上皮細胞的增殖、移行及膠原分泌。張鳳妍等⑥探討表皮生長因子、白細胞介素1、干擾素和生長抑素8肽在晶狀體后囊膜混濁形成中的作用及影響膠原合成的機制,發(fā)現(xiàn)表皮生長因子、白細胞介素1參與晶狀體后囊膜混濁形成時的膠原合成,干擾素和生長抑素8肽的作用提示其可用于防治晶狀體后囊膜混濁。在本研究中,10μg/LrhbFGF作用后,HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白濃度為53.5±5.4μg/L,較正常組(38.5±2.3μg/L)明顯升高,說明rhbFGF能促進HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白的合成。經(jīng)Ele作用后,HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白的濃度為29.5±2.9μg/L,較rhbFGF組明顯下降。結(jié)果提示,Ele能抑制HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白的合成。我們還發(fā)現(xiàn),10μg/LrhbFGF作用后,HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白濃度為1.27±0.29μg/L,較正常組(0.83±0.12μg/L)明顯升高,說明rhbFGF能促進HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白的合成。經(jīng)Ele作用后,HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白的濃度為0.69±0.11μg/L,較rhbFGF組明顯下降。本結(jié)果提示,Ele能抑制HLE B3內(nèi)Ⅲ型膠原蛋白的合成。本結(jié)果提示,rhbFGF在促進HLE B3增殖的同時,也能促進HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白的合成;Ele能有效抑制HLE B3內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白的合成。進一步說明作為ECM重要成分的Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白,是構(gòu)成纖維化性混濁的重要原因,也是導(dǎo)致晶狀體后囊膜纖維化并發(fā)生混濁的重要機制。Ele有望成為防治后發(fā)性白內(nèi)障的有效藥物。
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