口腔致病菌在生物膜狀態(tài)和浮游態(tài)中的特性比較
【摘要】在人類口腔中存在著種類繁多的天然菌群,這些細菌以牙菌斑生物膜的形式生長。菌斑生物膜作為人類齲病和牙周病的主要致病因素,有諸多代謝特點和生理現(xiàn)象明顯不同于浮游態(tài)的細菌。下面就數(shù)種主要的口腔致病菌在生物膜狀態(tài)和浮游態(tài)下的特性,如對抗菌劑的敏感性、基因表達和信號傳導(dǎo)、耐酸性等方面的研究進展作一綜述。
【關(guān)鍵詞】口腔致病菌;生物膜;浮游狀態(tài)
在自然界中,90%以上的微生物是以生物膜形式生存生長的,該結(jié)構(gòu)通常為菌體在逆境條件下產(chǎn)生①。生物膜是一種由基質(zhì)包裹的相互黏附或附著于體表或界面的微生物群體,而牙菌斑作為一種典型的細菌性生物膜,是研究最多的生物被膜之一,其中大約包含500種微生物,是人類感染性疾病如齲病和牙周病的主要致病因素②。
在牙菌斑中,細菌從浮游的生長狀態(tài)到成熟的生物膜,涉及諸多生物學(xué)特性的改變。下面以數(shù)種主要口腔致病菌為例結(jié)合生物膜的研究進展,對其在生物膜狀態(tài)和浮游態(tài)下的主要特性作一綜述。
1、細菌對抗菌劑的敏感性
抗菌劑的使用是控制牙菌斑的一種重要手段。有不少學(xué)者用不同的檢測手段證實,生物膜中的細菌對抗菌劑的敏感性較處于浮游狀態(tài)時要低很多,而口腔細菌又常以生物膜的方式致病,對多數(shù)抗菌劑具有較強的抵抗力。生物膜對抗菌劑的耐藥性是一個多因素過程,主要跟生物膜結(jié)構(gòu)和生理特征有關(guān)③。臨床上常規(guī)采用的體外藥物敏感檢測的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度值,用的是浮游態(tài)細菌,而非生物膜,這就造成了實驗室的藥敏結(jié)果與臨床療效之間存在差異。
生物膜對抗菌劑的敏感性大大降低與生物膜中的持留細胞(persistercell)有關(guān)系④。持留細胞被認(rèn)為是一類數(shù)量極少并處于不生長狀態(tài)的細菌細胞,既存在于浮游狀態(tài)下,也存在于生物膜中,是菌群中大量正常細胞的不同表型⑤,不同劑量的抗菌劑作用于生物膜后,總會有少量的細胞能存活下來,其表型發(fā)生轉(zhuǎn)化并與親代正常細胞具有相同的性質(zhì),即為持留細胞。正因為持留細胞對抗菌劑的高耐受性和對生物膜的專有性,生物膜中的細菌較其在浮游態(tài)下對抗菌劑的耐受性大大提高。此外,許多治療因子在到達細菌之前與生物膜胞外多糖基質(zhì)結(jié)合,其抗菌性失活??傊鲜鲅芯繌娬{(diào)了為什么口腔細菌的研究應(yīng)該在生物膜上進行,而不應(yīng)建立在浮游態(tài)細菌基礎(chǔ)上的緣由⑥。
1.1 細菌對氯己定的敏感性
氯己定(Chlorhexidine,CHX)作為一種口腔黏膜消毒劑,具有廣譜抗菌活性和強大的抑菌作用,其漱口水廣泛用于口腔感染。Wilson等⑦通過生物膜厚度發(fā)酵裝置來形成血鏈球菌生物膜和浮游態(tài)血鏈球菌,分別暴露于CHX和十六烷基銨基吡啶(cetylpyridiniumchloride,CPC),結(jié)果在生物膜中的血鏈球菌對CHX和CPC的敏感性較浮游態(tài)下的血鏈球菌更低。Decker等⑧以釉質(zhì)和載玻片作為載體,在熒光顯微鏡下通過死菌和活菌計數(shù)計算活菌百分率來評價浮游態(tài)和生物膜血鏈球菌對CHX的敏感性。結(jié)果顯示,經(jīng)過CHX對浮游態(tài)血鏈球菌的預(yù)處理后,黏附后活菌百分率的平均值分別為14%~18%(釉質(zhì))和24%~25%(載玻片);相反,未經(jīng)CHX預(yù)處理的生物膜血鏈球菌平均活菌百分率分別為70%~75%(釉質(zhì))和68%(載玻片)。
1.2 細菌對麝香草酚的敏感性
麝香草酚作為口腔科常用制劑中的成分之一,具有抗菌性和抗真菌性等藥理特性。白假絲酵母菌具有潛在的毒力和致病性并能形成生物膜以抵制傳統(tǒng)的抗真菌劑,Braga等⑨通過白假絲酵母菌ATCC3153A和ATCCMYA2876的檢測發(fā)現(xiàn),麝香草酚能干預(yù)白假絲酵母菌生物膜形成的初始階段和成熟階段生物膜的形成,在浮游態(tài)細胞最低抑菌濃度2倍的情況下,生物膜細菌的代謝活性僅僅降低了90%左右??梢娚锬ぷ鳛橐环N多因素現(xiàn)象,麝香草酚的多種機制能影響其形成的不同階段。
1.3 細菌對地莫匹醇的敏感性
地莫匹醇可通過抑制口腔微生物黏附至牙面而影響牙菌斑生物膜的發(fā)展和成熟,在一定程度上還影響細菌的代謝從而預(yù)防和治療牙齦炎⑩。Burgemeister等⑾⑿通過熒光染色計算活菌數(shù)發(fā)現(xiàn),在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的地莫匹醇-氯化氫溶液中,血鏈球菌生物膜和浮游血鏈球菌的活菌數(shù)均顯著下降;而暴露于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的地莫匹醇-氯化氫溶液中時,血鏈球菌生物膜細菌總數(shù)并未下降,浮游態(tài)血鏈球菌的活菌數(shù)則下降。即在生物膜形成的初始階段,地莫匹醇-氯化氫溶液在0.05%或是更高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下有殺菌作用,因而有較大的臨床應(yīng)用前景。
1.4 可見光和過氧化氫的抗菌協(xié)作效應(yīng)
Steinberg等⒀利用可見光和過氧化氫對浮游態(tài)變異鏈球菌的抗菌協(xié)作效應(yīng)進行了證實性研究,在其研究中檢測到一種可見光和過氧化氫結(jié)合體對生物膜中變異鏈球菌的活力和基因表達的影響力。結(jié)果顯示,生物膜中的變異鏈球菌在濃度為3~300mol/L過氧化氫中暴露于波長400~500nm可見光下0.5或1min,抗菌效果通過對死菌或活菌計數(shù),可見光和過氧化氫結(jié)合體在激光共聚焦掃描顯微鏡下對于生物膜每一層都有一種協(xié)同性的抗菌效果。此外,生物膜細菌在此種方法下較浮游態(tài)細菌更有效。綜上可見,可見光和過氧化氫結(jié)合體可作為最低限度的抗菌過程應(yīng)用到生物膜相關(guān)疾病的防治中。
2、細菌的基因表達和信號傳導(dǎo)
在牙菌斑生物膜中,細菌在應(yīng)對生物膜所處的復(fù)雜環(huán)境時將啟動一套完全不同的基因系統(tǒng),有不同的基因表達形式。Maira-Litr?觃n等⒁發(fā)現(xiàn),生物膜中的菌細胞會表達一些跟浮游細胞不同的表型。細菌在生物膜中并非以游離狀態(tài)存在,而為了適應(yīng)周邊環(huán)境,可通過種間或種內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路來協(xié)調(diào)群體的行為⒂,使群體細菌表現(xiàn)出共同的生物學(xué)行為。
2.1 基因的轉(zhuǎn)錄分析
變異鏈球菌作為一種主要的口腔致病菌,常以生物膜的形式生活。Shemesh等⒃采用體外比較轉(zhuǎn)錄分析的方法來鑒定變異鏈球菌在生物膜狀態(tài)下和浮游狀態(tài)時的基因表達,其DNA序列分析顯示,大約12%的基因有顯著性差異表達;在相對于浮游狀態(tài)而言的生物膜狀態(tài)下,有139種基因被激活,104種基因被抑制,有20種被選擇基因的差異表達通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)得以鑒定。該研究對變異鏈球菌生物膜生長過程中的基因表達提供了新的見解。
2.2 不同糖源下的轉(zhuǎn)移酶應(yīng)答
菌斑生物膜所處的環(huán)境反過來會對細菌的基因表達產(chǎn)生影響。Shemesh等⒄采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng),體外對比變異鏈球菌在生物膜狀態(tài)和浮游狀態(tài)下的相關(guān)基因?qū)ζ咸烟呛驼崽堑膽?yīng)答。結(jié)果顯示,在相對于浮游狀態(tài)而言的生物膜狀態(tài)下,所有變異鏈球菌被檢基因在生物膜中起正調(diào)節(jié)作用。在他們所檢測基因中,做得最多的是對編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase,gtf)和果糖基轉(zhuǎn)移酶(frucosyltransferase,ftf)基因的觀察。結(jié)果顯示,gtfBmRNA的誘導(dǎo)作用在生物膜形成中相對于浮游態(tài)是22倍,gtfCmRNA的增長作用在生物膜形成中相對于浮游態(tài)是14.8倍,ftfmRNA的誘導(dǎo)作用在生物膜中相對于浮游態(tài)是11.8倍。盡管在有蔗糖存在時生物膜相關(guān)基因表達中的正性調(diào)節(jié)有顯著意義,但是葡萄糖的加入會降低大部分基因的表達。由此可見,糖源的種類對生物膜狀態(tài)和浮游態(tài)下細菌gtf和ftf基因的表達起著重要的影響。
2.3 生物膜的抗血清反應(yīng)
口腔血鏈球菌是牙菌斑生物膜中的先鋒菌,也是口腔正常菌群的優(yōu)勢菌之一,與其相對的浮游生物細胞在表型上完全不同。Black等⒅通過對血鏈球菌生物膜和浮游生物細胞的表型分析證實,生長方式影響血鏈球菌的表面性質(zhì)。血鏈球菌生物膜經(jīng)過抗血清反應(yīng)后,其生物膜細菌基因庫中顯示產(chǎn)生了32種基因重組克隆,表達了21種不同的血鏈球菌蛋白;另外,纖維黏附素CshA及其疏水性表達在血鏈球菌生物膜中明顯提高。在對所選用的大腸桿菌的不同分析中,其生物膜的抗血清反應(yīng)有5次較浮游態(tài)細菌抗血清反應(yīng)要強,即在生物膜細胞中,由cshA基因和cna基因編碼的表面膠原蛋白呈正性調(diào)節(jié),然而在浮游態(tài)中則不然。
2.4 密度感應(yīng)信號系統(tǒng)
密度感應(yīng)信號(quorumsensingsignal,QS)系統(tǒng)對牙菌斑生物膜的形成具有重要作用⒆,可改變菌體生理特性并影響生物膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。對鏈球菌QS系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn),QS系統(tǒng)可誘導(dǎo)細菌接受外源性DNA,如生活在生物膜中的變異鏈球菌較浮游態(tài)下的變異鏈球菌更容易接受外源DNA,而且變異鏈球菌的轉(zhuǎn)化頻率是其浮游態(tài)的10~600倍⒇。大多數(shù)細菌利用QS系統(tǒng)調(diào)控其特定的生理功能,而且不同于浮游態(tài)下的細菌生長特點。生物膜內(nèi)細菌的生理特性由密度感應(yīng)信號系統(tǒng)調(diào)控,進而影響生物膜的發(fā)展成熟⑥。
3、細菌的代謝特點
3.1 細菌的耐酸性
成熟的生物膜細胞較在浮游狀態(tài)下對于酸有更強的抵抗力。變異鏈球菌可在較低pH值環(huán)境下誘導(dǎo)出酸耐受反應(yīng)以增強其生存力。Welin-Neilands等在通過死菌和活菌熒光染色研究變異鏈球菌生物膜的酸耐受反應(yīng)能力及其耐酸性過程中發(fā)現(xiàn),不同的變異鏈球菌菌株生物膜細胞的酸耐受反應(yīng)能力是其相應(yīng)浮游態(tài)下的820~7.0×104倍,較浮游細胞有更強的耐酸性。同時他們還發(fā)現(xiàn),氟化物有抑制酸耐受反應(yīng)的誘導(dǎo)作用,在pH3.5環(huán)境下僅有77%的細胞生存率??梢?,變異鏈球菌的不同菌株具有不同的酸耐受度和不同的誘導(dǎo)酸耐受反應(yīng)的能力。
3.2 細菌的抗饑餓性
與浮游態(tài)下的細菌相比較,生物膜中的細菌代謝特點具有多樣性和復(fù)雜性。Zhu等通過激光共聚焦掃描顯微鏡和免疫熒光技術(shù)測定發(fā)現(xiàn),生物膜狀態(tài)和浮游態(tài)中的變異鏈球菌同時接受24h無底物的饑餓處理后,變異鏈球菌在生物膜狀態(tài)下較浮游態(tài)具有更強的耐饑餓能力。
4、結(jié)束語
由于生物膜中的細菌無論是基因表達、代謝作用,還是其他的生理現(xiàn)象都與浮游態(tài)下的細菌有較大的差異;因此,研究生物膜中細菌的生理代謝特點,對于進一步明確齲病和牙周病的發(fā)病機制、防治措施以及指導(dǎo)臨床用藥均具有重要的臨床意義。
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