1.2 半定量RT－PCR  采用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取44例標(biāo)本的總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性。符合要求的標(biāo)準(zhǔn)：OD260/OD280在1.8～2.0；電泳顯示28S/18S約為2，5S很弱或沒有。采用QuantReversetranscriptase（天根生化科技）將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）和BAI1片段，反應(yīng)結(jié)束后行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，對電泳結(jié)果進(jìn)行圖像分析（天能GIS1000數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)），記錄每個(gè)條帶的灰度值，將實(shí)驗(yàn)組灰度值和與之相對應(yīng)的內(nèi)參照組灰度相比，將比值作為BAI1相對表達(dá)水平的參數(shù)。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物序列:BAI1上游引物：5'-CCGCTGTGTTTCCATTGACTA-3'，下游引物：5'-ACCACAAACACGGATGCTTCA-3'，擴(kuò)增片段大小為564bp；GAPDH上游引物：5'-CATCCATGACAACTTTGGTATC-3'，下游引物：5'-CCATCACGCCACAGTTTC-3'，擴(kuò)增片段大小為100bp。PCR條件為95℃4min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，BAI128循環(huán)，GAPDH26循環(huán)；72℃10min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各組BAI1mRNA表達(dá)水平的相對灰度值以x±s表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2、結(jié)果

BAI1mRNA在6例（100%）對照組腦組織和26例（68.4%）膠質(zhì)瘤中表達(dá)。相對灰度值分別為：對照組0.870±0.140，Ⅱ級0.213±0.078，Ⅲ級0.266±0.087，Ⅳ級0.151±0.073。4組間BAI1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)＝9.378，P＝0.000；對照組高于Ⅱ級膠質(zhì)瘤、Ⅲ級膠質(zhì)瘤、Ⅳ級膠質(zhì)瘤組，均P＝0.000；各膠質(zhì)瘤組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1，2）。

3 、討論

近年來，抑制腫瘤血管生成的基因治療日益受到重視。促血管生成因素與血管生成抑制因素間的平衡是新生血管是否形成的決定因素；向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染血管生成抑制因子基因，增加其在腫瘤局部的表達(dá)，有利于使這種平衡向抑制血管生成的方面傾斜，達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。血管生成抑制因子包括血小板凝血酶敏感蛋白1（TSP1）、血管抑素、內(nèi)皮抑素、血小板4因子（PF4）、膠質(zhì)瘤源性血管生成抑制因子（GD-AIF）和BAI1等。

BAI1的胞外區(qū)含有5個(gè)TSP1重復(fù)序列，可抑制由堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）誘導(dǎo)的血管增生反應(yīng)^①，其特異性在腦組織中表達(dá)，Northern雜交顯示：在胚胎和成人腦中皆有表達(dá)，但其mRNA的亞區(qū)在不同的解剖區(qū)域呈不均勻分布。BAI1mRNA的表達(dá)水平在大腦皮質(zhì)最高，小腦、尾狀核、殼核、杏仁核、海馬次之，髓質(zhì)、黑質(zhì)、下丘腦核、丘腦表達(dá)最弱，而胼胝體和脊髓組織中無表達(dá)^③。這與特異性在神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)的神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）的表達(dá)形式類似^④，而與特異性在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)形式明顯不同^⑤。說明BAI1mRNA主要在神經(jīng)元而不是星形膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄表達(dá)。Nam等^②發(fā)現(xiàn)：BAI1mRNA僅在26例GBM中的9例和全部5例良性膠質(zhì)瘤中表達(dá)；Kaur等^⑥對28個(gè)GBM細(xì)胞系的研究結(jié)果也顯示：多數(shù)BAI1mRNA表達(dá)缺失，但在8個(gè)細(xì)胞系中仍然發(fā)現(xiàn)了BAI1mRNA。

本研究檢測了BAI1mRNA在對照組腦組織和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤中表達(dá)的情況，結(jié)果顯示：對照組腦組織均有BAI1表達(dá)，12例Ⅱ級膠質(zhì)瘤中BAI1表達(dá)缺失5例，12例Ⅲ級膠質(zhì)瘤中BAI1表達(dá)缺失2例，14例Ⅳ級膠質(zhì)瘤中BAI1表達(dá)缺失5例。BAI1mRNA在膠質(zhì)瘤標(biāo)本的表達(dá)陽性率為68.4%，與BAI1mRNA在肺癌的表達(dá)（79.2%）^⑦類似。膠質(zhì)瘤BAI1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著性低于對照組腦組織，說明BAI1可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)展中起促進(jìn)作用。令人難以理解的是，BAI1mRNA在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤的表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。高級別膠質(zhì)瘤比低級別膠質(zhì)瘤的血管密度明顯增加，且Dunn等^⑧證實(shí)：在血管增生過程中具有重要作用的促血管生長因子（VEGF）表達(dá)顯著增加，據(jù)此推斷，BAI1mRNA的表達(dá)水平應(yīng)該與膠質(zhì)瘤的級別呈負(fù)相關(guān)。但本研究結(jié)果卻與此推斷不符，考慮原因可能有以下兩點(diǎn)：①部分膠質(zhì)瘤雖有BAI1mRNA表達(dá)，但是不能翻譯成BAI1蛋白。基因是通過其最終表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)來發(fā)揮作用的，而Kaur等^⑥發(fā)現(xiàn)：在8個(gè)有BAI1mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的GBM細(xì)胞系中檢測不到BAI1蛋白，說明BAI1可能進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，使蛋白表達(dá)缺失或表達(dá)水平很低。目前尚缺乏腫瘤實(shí)體內(nèi)的類似報(bào)道，仍需進(jìn)一步證實(shí)。②部分膠質(zhì)瘤有BAImRNA表達(dá)并且翻譯成BAI1蛋白，但是在腦腫瘤復(fù)雜的病理生理環(huán)境下，促血管生成因素和血管生成抑制因素間的平衡可被不同的方式打破，BAI1抑制血管生成的作用可能被腫瘤內(nèi)其他因子所克服。使得BAI1最終不能發(fā)揮抑制血管增生的作用，BAI1陽性細(xì)胞仍發(fā)展成為GBM，使得BAI1蛋白陽性和陰性GBM的血管密度并沒有顯著性差異^⑥。這與結(jié)直腸癌、肺癌不同，Hatanaka等^⑦和Fukushima等^⑨分別發(fā)現(xiàn)：結(jié)、直腸癌和肺癌中BAI1基因的表達(dá)水平與腫瘤內(nèi)血管密度呈負(fù)相關(guān)。

本研究證實(shí)：BAI1mRNA在部分膠質(zhì)瘤中表達(dá)缺失，可能對膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展具有促進(jìn)作用。因此，BAI1可能成為腦膠質(zhì)瘤基因治療的新靶點(diǎn)。目前，此類研究已經(jīng)開展并取得了初步成果。直接脂質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)BAI1胞外段基因到兔模型的角膜，有效抑制了角膜新生血管的生成^⑩。Kang等^⑾和肖新如等^⑿的研究表明：轉(zhuǎn)染編碼BAI1腺病毒載體的GBM細(xì)胞系在mRNA和蛋白水平均有BAI1表達(dá)；小鼠腦內(nèi)接種GBM細(xì)胞系U87MG，腫瘤形成后在瘤內(nèi)注射BAI1重組腺病毒，腫瘤生長明顯受到抑制，形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)腫瘤廣泛性壞死、瘤內(nèi)血管密度降低等變化。這說明BAI1可作為膠質(zhì)瘤，尤其是GBM基因療法的候選基因。

綜上所述，BAI1在部分膠質(zhì)瘤中表達(dá)缺失，但缺失的機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。BAI1具有強(qiáng)烈抑制血管生成的作用，因此有望成為膠質(zhì)瘤基因治療的選擇之一。

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