【摘要】目的：研究牙齦卟啉單胞菌及其可溶性毒力因子對(duì)人多形核白細(xì)胞的影響，探討其導(dǎo)致慢性牙周炎發(fā)生的作用機(jī)制。方法：采集健康中老年人外周血，利用透射電鏡觀察多形核白細(xì)胞培養(yǎng)組(對(duì)照組)與牙齦卟啉單胞菌超聲粉碎濾液共同培養(yǎng)組(實(shí)驗(yàn)組)多形核白細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組多形核白細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化，而對(duì)照組細(xì)胞無(wú)明顯變化;實(shí)驗(yàn)組脫顆粒白細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較對(duì)照組顯著增多(P<0.001)。結(jié)論牙齦卟啉單胞菌可誘導(dǎo)多形核白細(xì)胞中顆粒向細(xì)胞周邊移動(dòng)并脫出，從而降低宿主的免疫能力,在慢性牙周炎發(fā)生中具有重要作用。

【關(guān)鍵詞】牙齦卟啉單胞菌 多形核白細(xì)胞 細(xì)胞脫顆粒

慢性牙周炎在中老年人中的患病率極高，是導(dǎo)致中老年人群牙齒缺失的主要原因。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.g)是慢性牙周炎重要的可疑致病菌之一^①，可通過(guò)其可溶性產(chǎn)物對(duì)牙周組織造成損傷，而多形核白細(xì)胞(polymorphonuclearleukocytes，PMNLs)是機(jī)體抵抗病菌入侵的第一道防線^②。在牙周炎發(fā)病過(guò)程中，宿主自身抵抗力的差異性是一個(gè)重要的因素，PMNLs的功能正常與否，直接關(guān)系著機(jī)體免疫力的高低。研究發(fā)現(xiàn)：牙周致病菌與PMNLs的相互作用在牙周病的致病機(jī)制中起重要作用^③④。目前針對(duì)P.g可溶性毒力因子對(duì)PMNLs影響的系統(tǒng)研究較少，本研究旨在通過(guò)觀察P.g超聲濾液誘發(fā)PMNLs脫顆粒的形態(tài)變化，探討P.g可溶性毒力因子對(duì)PMNLs的影響。

1、材料與方法

1.1 細(xì)菌菌種與研究對(duì)象

P.g標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33277(購(gòu)自上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所)。選擇10例健康老年人為試驗(yàn)對(duì)象，男女各5例，平均年齡(60±5)歲，所有受試者均知情同意。受試者的選擇標(biāo)準(zhǔn)包括：無(wú)全身性疾病;近3個(gè)月無(wú)服用抗生素類(lèi)藥物;無(wú)活動(dòng)性齲，牙周健康。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)及超聲濾液的制備

將P.g接種在血液瓊脂培養(yǎng)基中(營(yíng)養(yǎng)瓊脂加10%新鮮兔血)，10%CO2的厭氧環(huán)境，37℃培養(yǎng)24h。將生長(zhǎng)良好的細(xì)菌用生理鹽水洗下，配置成2單位麥?zhǔn)媳葷峁艿臐舛?6×108CFU/ml)，將該濃度的細(xì)菌置超聲儀中超聲粉碎(PG115型超聲破碎儀，德國(guó)MSE公司)，取上清進(jìn)行過(guò)濾，濾過(guò)液置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 外周血PMNLs的分離培養(yǎng)

取10例健康老年人靜脈血20ml，肝素抗凝后，用不連續(xù)密度梯度Percoll分離PMNLs。先將70%濃度Percoll溶液緩慢加入試管中，再加50%濃度的Percoll溶液，使之形成滿意的界面。加抗凝血(約1.5ml)后離心25min，收取多形核細(xì)胞層，將細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)液洗滌2次，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液(5×106/ml)，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h。

1.2.3 細(xì)菌超聲濾液作用于PMNLs

隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組在PMNLs內(nèi)加入P.g超聲粉碎濾液200μl，對(duì)照組的PMNLs內(nèi)加入RPMI1640培養(yǎng)液。在0、10、30和60min4個(gè)時(shí)間段進(jìn)行電鏡觀察。

1.2.4 透射電鏡樣品的制備

將細(xì)胞懸液離心15min，沉積細(xì)胞經(jīng)2.5%戊二醛固定，1%鋨酸固定后，乙醇系列脫水，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片后用醋酸雙氧及檸檬鉛雙重染色，透射電鏡(JEM1200EX)觀察、攝片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用成組設(shè)計(jì)兩樣本均數(shù)比較t檢驗(yàn)。

2、結(jié)果

2.1 P.g超聲濾液誘發(fā)PMNLs脫顆粒的形態(tài)變化

電鏡觀察顯示：對(duì)照組中各時(shí)間點(diǎn)PMNLs形態(tài)完整，細(xì)胞漿內(nèi)無(wú)明顯顆粒，細(xì)胞膜邊緣整齊，細(xì)胞核呈分葉狀、飽滿(圖1A)。而實(shí)驗(yàn)組中PMNLs在P.g超聲濾液作用10min時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有明顯的顆粒聚集并向細(xì)胞周邊移動(dòng)的現(xiàn)象(圖1B)，在30和60min時(shí)，PMNLs出現(xiàn)脫顆粒現(xiàn)象，同時(shí)伴有細(xì)胞不完整，細(xì)胞膜不光滑，細(xì)胞核皺縮的現(xiàn)象(細(xì)胞凋亡出現(xiàn))，甚至出現(xiàn)細(xì)胞裂解死亡。

2.2 脫顆粒的PMNLs與正常PMNLs百分?jǐn)?shù)的比較

P.g的超聲濾液加入PMNLs后在0、10、30、60min4個(gè)時(shí)間點(diǎn)利用電鏡觀察。結(jié)果顯示：在10、30和60min3個(gè)時(shí)間點(diǎn)變現(xiàn)出差異，實(shí)驗(yàn)組在10min時(shí)脫顆粒的PMNLs增多，在之后的時(shí)間里得到了持續(xù)，而對(duì)照組波動(dòng)較實(shí)驗(yàn)組穩(wěn)定。兩組脫顆粒的PMNLs數(shù)

3、討論

老年人的牙周附著喪失重于年輕人，慢性牙周炎多見(jiàn)于中老年人。牙齦卟啉單胞菌是目前公認(rèn)的牙周致病菌之一，也是牙周微生物領(lǐng)域重點(diǎn)研究的厭氧菌之一，與慢性牙周炎、侵襲性牙周炎、牙周膿腫和牙髓感染以及伴發(fā)性全身性系統(tǒng)疾病密切相關(guān)^⑤⑥。病原菌致病是一個(gè)多因素共同作用的過(guò)程，有參與基本生理過(guò)程的看家基因和多種毒力基因參與。P.g基因的多態(tài)性與復(fù)雜性使得其致病機(jī)制迄今尚不明了，已發(fā)現(xiàn)的P.g的毒力因子包括菌毛、牙齦素、脂多糖(LPS)等^⑦⑧。

PMNLs是機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，既是白細(xì)胞中功能最活躍的多功能細(xì)胞，也是參與炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞。PMNLs具有吞噬作用，能夠在感染組織中遷移,預(yù)防炎癥的擴(kuò)散，是細(xì)胞免疫和體液免疫的積極參與者，主要通過(guò)釋放多種蛋白水解酶而發(fā)揮殺菌功能^⑨。當(dāng)PMNLs不能正常行使其功能時(shí)，細(xì)菌不僅不會(huì)被殺死，而且可以抑制溶酶體和吞噬體的融合。即便是PMNLs的吞噬能力正常，但對(duì)趨化性反應(yīng)遲鈍，不能游走至趨化因子刺激的部位，會(huì)使感染經(jīng)久不愈。PMNLs的殺菌作用主要依賴于吞噬溶酶體中顆粒成分所調(diào)節(jié)的非氧化機(jī)制。顆粒成分的細(xì)胞外釋放可能抵消PMNLs內(nèi)殺傷作用，降低局部的免疫防御功能和屏障作用。導(dǎo)致溶酶體成分細(xì)胞外分泌的主動(dòng)過(guò)程為細(xì)胞支架的聚合，它是顆粒向細(xì)胞周邊的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制^⑨。此外，脫顆粒將導(dǎo)致牙周組織內(nèi)溶酶體混合成分濃度的增加，它不僅有害于宿主細(xì)胞，而且還可以參與牙周組織的病理過(guò)程加劇炎癥反應(yīng)^⑩。

將P.g用超聲波粉碎機(jī)粉碎，濾液內(nèi)會(huì)含有該菌的絕大部分可溶性毒力因子。研究這種濾液既可以避免菌體本身的不確定性又能避免單一成分的不完整性，是一種方便、可靠的有效途徑^④。本實(shí)驗(yàn)將P.g超聲粉碎濾液與健康中老年人外周血中的PMNLs共同培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組(在PMNLs中加入P.g超聲粉碎濾液)和對(duì)照組(在含抗毒血清的PMNLs中加入P.g超聲粉碎濾液)存在顯著差異，實(shí)驗(yàn)組脫粒的PMNLs百分?jǐn)?shù)明顯高于對(duì)照組，同時(shí)隨時(shí)間的延長(zhǎng)，脫顆粒現(xiàn)象更加明顯。

本研究認(rèn)為，P.g的超聲粉碎濾液能夠使健康中老年人外周血中的PMNLs發(fā)生脫顆粒，從而通過(guò)降低宿主的免疫功能導(dǎo)致牙周炎的發(fā)生、發(fā)展。值得注意的是，口腔是一個(gè)多種微生物定植的微生態(tài)系統(tǒng)，各種微生物之間相互依存、相互制約，不能單純的用單一致病菌對(duì)組織的損害來(lái)說(shuō)明口腔微生物群的作用。此外，不同個(gè)體的PMNLs的自身存在功能的差異，是否會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生差異，還需在今后的工作中進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Ezzo PJ，Cutler CW.Microorganisms as risk indicators for periodontal disease.Periodontol,2000;2003，32(1):23 4.

[2]Van Dyke TE，Vaikuntam J.Neutrophil function and dys function in periodontal disease.Curr Opin Periodontol,1994;2:19 27.

[3]王惠寧,潘乙懷,金尚青,等.牙齦卟啉菌表面相關(guān)物質(zhì)對(duì)多形核白細(xì)胞的影響.口腔醫(yī)學(xué)研究，2004;20(6):583 5.

[4]李,王萬(wàn)成.伴放線放線桿菌超聲粉碎液誘導(dǎo)外周血中多形核白細(xì)胞脫粒的體外研究.口腔醫(yī)學(xué)研究，2006;22(5):504 6.

[5]周婷,徐屹,丁一等.慢性牙周炎齦下菌斑中五種牙周可疑致病微生物的分布.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2007;25(5)：470 3.

[6]方廠云,蘇征,陳蕾等.牙齦卟啉單胞菌脂多糖對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞膠原吞噬作用的影響.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2007;25(4)：339 41.

[7]Zhao L，Wu YF，Meng S,et al.Prevalence of fimA genotypes of Porphyromonas gingivalis and periodontal health status in Chinese adults.J Periodontal Res，2007;42(6)：511 7.

[8]楊明華，李 升，肖建平，等.中藥的大黃治療重度牙周炎的臨床觀察.口腔醫(yī)學(xué)研究，2008;24(3)：305 7.

[9]Lowell CA，Berton G.Integrin signal transduction in myeloid leukocytes.J Leukoc Biol，1999;65(3):313 20.

[10]Lamster IB.The host response in gingival crevicular fluid：potential application in periodontitis clinical trials.J Periodontol,1992;63(12):1117 23.