【摘要】目的:探討子宮內(nèi)膜癌組織中中期因子(MK)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，為子宮內(nèi)膜癌的化學(xué)防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)49例子宮內(nèi)膜癌和30例正常子宮內(nèi)膜組織中MK和VEGF蛋的表達(dá)，并結(jié)合臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果:子宮內(nèi)膜癌組織中MK和VEGF蛋白的表達(dá)均明顯高于正常子宮內(nèi)膜，MK蛋白的高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的臨床分期及組織學(xué)分級(jí)相關(guān)性顯著(r=1.55，P<0.01;r=1.11，P<0.05)，MK與VEGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性者VEGF明顯高于陰性者，二者呈正相關(guān)(r=1.76，P<0.05)。結(jié)論:MK蛋白過(guò)表達(dá)可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展，并與VEGF相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】中期因子;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;子宮內(nèi)膜癌;免疫組織化學(xué)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的深入研究，表明腫瘤的形成和進(jìn)展是一個(gè)多因素參與、多基因改變的復(fù)雜過(guò)程^①②。本課題擬通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜腺癌患者組織中中期因子(MK)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)水平，結(jié)合臨床病學(xué)特征進(jìn)行分析，判斷其作為子宮內(nèi)膜腺癌惡性程度評(píng)估和判斷預(yù)后的價(jià)值。

1、資料與方法

1.1 一般資料

49例子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本取自2003年8月至2009年10月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院住院患者，年齡35～82歲，平均年齡52歲，所有病例術(shù)前均未作放療或化療，術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為子宮內(nèi)膜樣腺癌。按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2000年修訂的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期20例，Ⅱ期24例，Ⅲ期5例;按《婦產(chǎn)科學(xué)》第6版病理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：高分化17例，中分化23例，低分化9例。正常子宮內(nèi)膜組織30例取自子宮肌瘤手術(shù)患者，經(jīng)病理證實(shí)。

1.2 試劑

濃縮型羊抗人MK多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)SantaCruze公司，工作濃度為1∶100。即用型鼠抗人VEGF單克隆抗體、免疫組化S P試劑盒及顯色底物DAB購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化SP法

步驟按說(shuō)明書(shū)操作，石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2孵育10min，熱抗原修復(fù)，正常山羊血清封閉，滴加1∶100稀釋的一抗MK、即用型VEGF抗體，4℃過(guò)夜，依次滴加生物素標(biāo)記二抗，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，封固。用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照，每例標(biāo)本常規(guī)進(jìn)行HE染色。

1.4 結(jié)果判斷

MK蛋白和VEGF蛋白均以腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，參照Muramatsu^③的判定標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)算著色腫瘤細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比，記錄染色強(qiáng)度分級(jí)，VEGF陽(yáng)性細(xì)胞0%為陰性(-)、1%～25%為弱陽(yáng)性(+)、26%～50%為中度陽(yáng)性(++)、>50%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++);MK陽(yáng)性細(xì)胞0%為陰性(-)、1%～5%為弱陽(yáng)性(+)、6%～15%為中度陽(yáng)性(++)、>15%為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2、結(jié)果

2.1 組織中MK及VEGF蛋白

MK蛋白陽(yáng)性染色定位于子宮內(nèi)膜癌腺上皮細(xì)胞的胞質(zhì)。49例子宮內(nèi)膜癌組織中，MK表達(dá)陽(yáng)性29例(59.0%)，其中強(qiáng)陽(yáng)性10例(34.5%)，陰性12例(41.4%)，陽(yáng)性7例(24.1%)。30例正常子宮內(nèi)膜組織中MK表達(dá)陰性。VEGF蛋白陽(yáng)性染色主要定位于子宮內(nèi)膜癌腺上皮細(xì)胞的胞質(zhì)。49例子宮內(nèi)膜癌組織中，VEGF表達(dá)陽(yáng)性33例(67.3%)，其中強(qiáng)陽(yáng)性15例(45.5%)，陽(yáng)性13例(39.3%)，弱陽(yáng)性5例(15.2%)。30例正常子宮內(nèi)膜組織中VEGF表達(dá)陰性。

2.2 MK及VEGF的蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌各臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

MK蛋白的表達(dá)與臨床分期和組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)(r=1.55,P<0.01;r=1.11,P<0.05)，而VEGF蛋白的表達(dá)與臨床分期呈正相關(guān)(r=1.36,P<0.01),和組織學(xué)分級(jí)無(wú)相關(guān)關(guān)系(r=0.24,P>0.05)。子宮內(nèi)膜癌組織中MK及VEGF蛋白表達(dá)

2.3 MK蛋白表達(dá)與VEGF間的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，子宮內(nèi)膜癌中MK蛋白與VEGF蛋白表達(dá)有相關(guān)性(r=1.76,P<0.05)。

3、討論

MK是1988年Muramat SU等發(fā)現(xiàn)的一種新基因，它與多向因子(pleiotro phin，PTN)一起組成一個(gè)新的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子。人的MK基因定位于11q11.2，正常成人組織中MK的表達(dá)高度受限^④⑤。近年來(lái)，MK與腫瘤的關(guān)系成為是MK研究的熱點(diǎn)，大多數(shù)人類(lèi)惡性腫瘤中的MK轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組織，MK在實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。MK主要通過(guò)促進(jìn)有絲分裂，抗腫瘤細(xì)胞凋亡及促腫瘤血管新生來(lái)發(fā)揮其致瘤活性。多種實(shí)體腫瘤如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌和所有消化系統(tǒng)腫瘤均有MK的高表達(dá)，并且這種高表達(dá)與組織類(lèi)型無(wú)關(guān)^⑥⑧。

VEGF被認(rèn)為是刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖最重要的因子之一，其主要生物學(xué)功能包括：(1)作用于內(nèi)皮細(xì)胞高度特異性地刺血內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，刺激血管生成^③;(2)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增生與遷移;(3)增加血管通透性;(4)促進(jìn)某些蛋白水解酶的作用使基質(zhì)降解。它在腫瘤微血管生成和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MK在正常子宮內(nèi)膜組織中沒(méi)有表達(dá)，而子宮內(nèi)膜癌組織中的陽(yáng)性率為59.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Rba等^⑨的報(bào)道相一致。癌組織內(nèi)過(guò)表達(dá)的MK主要定位于癌細(xì)胞的胞質(zhì)。將MK蛋白表達(dá)與反映子宮內(nèi)膜癌惡性生物學(xué)行為的各項(xiàng)臨床病理參數(shù)結(jié)合起來(lái)分析，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌組織中MK表達(dá)與腫瘤臨床分期和組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)。因此，MK蛋白的表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌惡性程度評(píng)估和判斷預(yù)后具有一定的價(jià)值。腫瘤的發(fā)生發(fā)展有賴(lài)于血管生成，MK與腫瘤血管新生關(guān)系的研究已成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)^⑩。為明確子宮內(nèi)膜癌中MK蛋白的表達(dá)是否也具有促進(jìn)血管新生的作用，將子宮內(nèi)膜癌中MK蛋白的表達(dá)與VEGF蛋白表達(dá)聯(lián)合起來(lái)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MK蛋白的表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)，因此推斷其與癌組織的血管新生關(guān)系密切，提示MK可能參與了子宮內(nèi)膜癌血管形成的調(diào)控^⑾。

研究表明，腫瘤切除后血清中MK水平下降。腫瘤患者尿中MK水平亦增高，與正常人比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？紤]MK作為一種分泌蛋白可以從多種途徑檢測(cè)到，那么血清、尿液中監(jiān)測(cè)MK水平的變化，可能有助于了解疾病進(jìn)展及治療情況，MK與VEGF的聯(lián)合檢測(cè)可能為臨床惡性腫瘤的診斷和預(yù)后估計(jì)提供有力幫助。

【參考文獻(xiàn)】

[1]趙昕,馬淑芬.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β及其Ⅱ型受體表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的關(guān)系.河北醫(yī)藥,2009,31：2231 2214.

[2]劉霞,張為遠(yuǎn),代蔭梅.子宮內(nèi)膜癌相關(guān)危險(xiǎn)因素研究進(jìn)展.中國(guó)全科醫(yī)學(xué),2009,12：1128 1131.

[3]Muramatsu H,Shirahama H,Yonezawa S,et al.Midkine,a retinoic acid inducible growth/diferentiation factor.immunochemical evidence for thefunction and distilbution.Dcv Biol,1993,159:392 402.

[4]Dai LC.Midkine translocated to nucleoli and invovled in carcinogenesis.World J Gastroenterol,2009,15:412 416.

[5]Fiegel HC,Kaifi JT,Wachowiak R,et al.Midkine is highly expressed in neuroblastoma tissues.Pediatr Surg Int,2008,24:1355 1359.

[6]Ohhashi S,Ohuchida K,Mizumoto K,et al.Midkine mRNA is overpressed in pancreatic cancer.Dig Dis Sci,2009,54:811 815.

[7]Ibusuki M,Fujimori H,Yamamoto Y,et al.Midkine in plasma as a novel breast cancer marker.Cancer Sci,2009,100:1735 1739.

[8]Xu Y,Qu X,Zhang X,et al.Midkine positively regulates the proliferation of human gastric cancer cells.Cancer Lett,2009,279:137 144.

[9]Rba SY,Noh SH,Kwak HJ,et al.Comparison of biological phenotypesaccording to midkine expression in gastric cancer cels an d their autocrine activities could be modulated by pentosan polysulfate.Cancer Lett,1997,118:37 46.

[10]Maehara H,Kaname T,Yanagi K,et al.Midkine as a novel target for antibody therapy in osteosarcoma.Biochem Biophys Res Commun,2007,358:757 762.

[11]Lucas S,Reindl T,Henze G,et al.Increased mindkine serum level in pediatric embryonal tumor patient.J Pediatr Hematol Oncol,2009,31:713 717.